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iGem 2020: Lac-Man

Wir entwickeln Lac-Man, den effektiven Wasserfilter für die Bekämpfung von Medikamentenrückständen im Abwasser.

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Unser Team für iGem 2020

Christopher Adelmann, Sebastian Brockmann, Carol Hanna, Samuel Kienzle, Fabian Klötzer, Nikolai Herdrich, Fiona Kühnel, Ann-Kathrin Löffler, Erik Müller, Helena Nowack, Jan Schlegel, Fabio Schmidberger, Elene Stehle, Franziska Welsch

Warum Wasserreinigung?

Wasser ist die grundlegendste Ressource unseres Planeten. Ob Pflanzen, Tiere oder der Mensch, wir alle sind für unser Überleben darauf angewiesen. Wasserknappheit und Reinheit verursachen weltweit Konflikte. Vor allem Wasserverschmutzung durch Medikamente, wie Antibiotika oder Östrogen-Derivate und andere nicht-medizinische Schadstoffe, erweist sich in den Industrienationen als ein aufkommendes Problem. 

Aus diesem Grund hat das EU-Parlament bereits 2013 eine Richtlinie über die ständige Analyse von Wasser innerhalb der Union verabschiedet [1]. Diese sogenannte „Watchlist“ wurde erstmals 2018 durch das Joint Research Centre ausgewertet [2]. Besonders auffällig waren die häufigen Überschreitungen der Predicted No-Effect Concentration (PNEC) für 17-alpha-Ethinylestradiol (EE2).  Auf der Beobachtungsliste stehen neben EE2 weitere potenziell gefährliche Substanzen für Mensch und Umwelt, wie Antibiotika und Diclofenac (Schmerzmittel). 

Viele dieser Moleküle zeichnen sich durch gemeinsame Eigenschaften aus. Beispielhaft zu nennen sind deren aromatische Ringstruktur und Wirkung als endokrine Disruptoren (z.B. EE2) und/oder die Toxizität dieser Verbindungen (z.B. Diclofenac, Carbamazepin), welche das Gefährdungspotenzial für Mensch und Tier begründen [3]. Aromatische Ringstrukturen dienen als potenzielle Angriffspunkte für Enzyme, die in verschiedenen Pilzen und Bakterien identifiziert werden konnten, sogenannte Laccasen.

Warum Laccasen?

Laccasen oxidieren Phenolgruppen, dabei wird der Sauerstoff des Substrates zu einem Radikal. Gleichzeitig wird dabei freier Sauerstoff zu Wasser reduziert. Die hier entstehenden Abbauprodukte weisen keine negativen Auswirkungen auf Menschen und Umwelt auf [4].

Unser Ziel ist die Verbesserung der Stabilität dieser Enzyme und eine Kombination von Laccasen auszuwählen, welche durch ihr breites Substratspektrum eine Vielzahl von Schadstoffen neutralisieren können.

Die von Trametes versicolor exprimierte Laccase soll mithilfe von Codon-Optimierung und Veränderung der N-terminalen Sequenz in Bezug auf Ihre pH- und Thermostabilität optimiert werden. Um die Eigenschaften der von uns modifizierten Laccase im Vorfeld analysieren zu können, bietet die Proteinmodellierung mit dem SWISS-MODEL eine vielversprechende Option [5].

Wie erfolgt die Laccase-Synthese?

Die Produktion der Laccasen erfolgt mittels klassischer biotechnologischer Vorgehensweise, hierbei wird die Template-DNA durch Restriktionsenzyme verdaut und in einen Expressionsvektor ligiert. Mit diesem werden kompetente Zellen transformiert. Zur Generierung eines stabilen Expressionsstammes wird dieser Expressionsvektor in das Genom integriert [6]. Da die oben genannte Laccase mehrere Disulfidbrücken besitzt, ist eine Produktion in eukaryotischen Zellen notwendig. Der Stamm Pichia pastoris X33. 2010 wurde bereits erfolgreich für die Synthese von Laccasen verwendet.

Warum Immobilisierung?

Um die Laccasen langfristig einsetzbar zu machen, eignet sich die Immobilisierung mittels eines mesoporösen Silicaschaums [7, 8]. 

Silizium-basierte Materialien sind gut geeignet, da sie umweltfreundlich, biokompatibel und vor allem resistent gegen organische Lösungsmittel und mikrobielle Angriffe sind. Ferner werden die Laccasen durch die Immobilisierung pH- und thermostabiler. Außerdem besitzen immobilisierte Enzyme eine bis zu 18-mal höhere Halbwertszeit [9]. Gleichzeitig sind die verwendeten Enzyme fest an die Matrix gebunden und müssen somit nicht wieder aus dem Abwasser gefiltert werden. Dieses Verfahren bietet überdies den Vorteil, dass so keine gentechnisch veränderten Organismen in die Umwelt freigesetzt werden können.

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